En 2033, dans un monde qui a été dévasté par une guerre nucléaire. Moscou n'est plus qu'une ville en ruine perpétuellement enneigée, et les rares habitants qui ont réussi à survivre se sont réfugiés dans les dédales du métro. Les restes de l'humanité se sont organisés, en aménageant les stations comme de véritables villes qui commercent entre elles. Mais les survivants ne sont pas en sécurité, des mutations ont transformé une partie de la population en mutants particulièrement violents, qui harcèlent continuellement les convois et les stations. De plus, deux factions ont fait du métro leur terrain d'affrontement : les "rouges" et les fachos, héritiers de l'URSS et du IIIe Reich qui se livrent une guerre sans merci pour la domination des restes de Moscou.

Le joueur incarne Chell, enfermée dans un laboratoire d'expérimentation sous la surveillance d'une intelligence artificielle du nom de GLaDOS. Cette dernière la pousse à effectuer des séries de tests sous la forme de salles ne s'ouvrant qu'après avoir résolu une série de puzzles et où Chell est enfermée.
Mais les intentions de GLaDOS restent obscure et les salles de plus en plus dangereuses ...

Plusieurs années après le premier Portal, le complexe d'Aperture Science est détruit. Chell, héroïne du premier épisode, est sortie de stase, aidée par Wheatley, un androïde sphérique et stupide chargé à la base de l'entretien du personnel en stase. Ce dernier va l'aider à s'échapper mais va entraîner le "réveil" de GLaDOS, ennemie du premier épisode.