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Le joueur incarne Chell, enfermée dans un laboratoire d'expérimentation sous la surveillance d'une intelligence artificielle du nom de GLaDOS. Cette dernière la pousse à effectuer des séries de tests sous la forme de salles ne s'ouvrant qu'après avoir résolu une série de puzzles et où Chell est enfermée.
Mais les intentions de GLaDOS restent obscure et les salles de plus en plus dangereuses ...