Plusieurs années après le premier Portal, le complexe d'Aperture Science est détruit. Chell, héroïne du premier épisode, est sortie de stase, aidée par Wheatley, un androïde sphérique et stupide chargé à la base de l'entretien du personnel en stase. Ce dernier va l'aider à s'échapper mais va entraîner le "réveil" de GLaDOS, ennemie du premier épisode.