Le joueur incarne Chell, enfermée dans un laboratoire d'expérimentation sous la surveillance d'une intelligence artificielle du nom de GLaDOS. Cette dernière la pousse à effectuer des séries de tests sous la forme de salles ne s'ouvrant qu'après avoir résolu une série de puzzles et où Chell est enfermée.
Mais les intentions de GLaDOS restent obscure et les salles de plus en plus dangereuses ...

Plusieurs années après le premier Portal, le complexe d'Aperture Science est détruit. Chell, héroïne du premier épisode, est sortie de stase, aidée par Wheatley, un androïde sphérique et stupide chargé à la base de l'entretien du personnel en stase. Ce dernier va l'aider à s'échapper mais va entraîner le "réveil" de GLaDOS, ennemie du premier épisode.

Razputin est un enfant doté de pouvoirs surnaturels qui s'échappe du cirque familial où il se sent rejeté par son père qui déteste les pouvoirs psychiques. Il s'invite alors dans une colonie de vacances qui a pour but de former des jeunes enfants à devenir des Psychonauts, c'est-à-dire des soldats de l'esprit. Peu à peu, il s'aperçoit que tout ne tourne pas rond dans la colonie, et qu'un complot est mis sur pied par l'un des professeurs pour diriger le monde : ce dernier vole les cerveaux des enfants pour se fabriquer un char psychique. C'est avec l'aide des agents Nein et Vodello, puis de l'agent Cruller, que Raz doit empêcher ce plan diabolique de toucher à sa fin et de sauver la colonie, ainsi que le monde.

Le FBI envoie l'agent Nelson Tethers, du département de résolution des casse-têtes, pour enquêter sur la fermeture de la fabrique de gommes à effacer installée à Scoggins, dans le Minnesota. Il s'agit d'une mission importante, puisque cette fabrique fournit habituellement la Maison Blanche en gommes à effacer.

L'enquête de Nelson Tethers n'est pas encore terminée à Scoggins et l'agent du FBI y retourne pour découvrir la vérité sur les gnomes et les disparitions de personnes.

Max découvre dans la rue un jouet, il le montre à Sam, ils découvrent qu'il est magique et Max se retrouve avec des pouvoirs psychiques. Ils vont découvrir d'autres jouets magiques au fil des aventures. Malheureusement, ces jouets attirent l'attention de personnes mal intentionnées qui veulent utiliser leurs pouvoirs pour conquérir le monde et la galaxie.