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Plusieurs années après le premier Portal, le complexe d'Aperture Science est détruit. Chell, héroïne du premier épisode, est sortie de stase, aidée par Wheatley, un androïde sphérique et stupide chargé à la base de l'entretien du personnel en stase. Ce dernier va l'aider à s'échapper mais va entraîner le "réveil" de GLaDOS, ennemie du premier épisode.

Le joueur incarne Chell, enfermée dans un laboratoire d'expérimentation sous la surveillance d'une intelligence artificielle du nom de GLaDOS. Cette dernière la pousse à effectuer des séries de tests sous la forme de salles ne s'ouvrant qu'après avoir résolu une série de puzzles et où Chell est enfermée.
Mais les intentions de GLaDOS restent obscure et les salles de plus en plus dangereuses ...

Pendant que le caporal Adrian Shephard et son équipe approchent de la zone d’atterrissage 117 au centre de Black Mesa, son hélicoptère est attaqué par des raies manta de Xen. Après le crash de son appareil, Shephard reprend conscience au milieu d'un rude combat entre les militaires et les aliens.