Le jeu prend place dans Sanctuaire. Quelque vingt ans auparavant, une poignée de héros anonymes ont sauvé ce monde dans Diablo II. Les guerriers ayant survécu au massacre des armées des enfers sont devenus fous suite à leurs actions et c'est une nouvelle génération de héros qui doit faire face aux forces du mal menaçant le monde de Sanctuaire.

Dans le ville de Dunwall, frappée par une terrible épidémie de peste, le joueur incarne Corvo Attano, le protecteur personnel de l'impératrice Jessamine Kaldwin.
Celui-ci assiste impuissant à l'assassinat de cette dernière, puis à l'enlèvement de la dauphine, Emily Kaldwin, et se retrouve désigné bouc émissaire de cet assassinat, qui se révèle bien vite être un complot politique.
Aidé par un groupe de résistants au Régent, Corvo décide de se venger de ceux qui lui ont fait du tort, tout en rétablissant la vérité et la situation.